765.隐蔽、狡猾、善变

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放疗(r)是肺癌必不可少的治疗方式。对于不适合手术的iiia和iiib期肺癌患者，根治性放化疗是治疗标准，这一点已被广泛接受。不幸的是，放疗后肿瘤的再生长是成功控制疾病的主要障碍。

临床前研究表明，放疗对原发部位和转移部位的肿瘤免疫微环境具有双重作用。一方面，局部照射有可能激活针对远离照射区域的肿瘤细胞的全身免疫反应，即远隔效应，由ole在1953年首次报道。r促进肿瘤抗原从垂死的肿瘤细胞中释放，上调hci类表达，并增加多种细胞因子和免疫效应分子的表达，包括白细胞介素(il)-1、细胞间粘附分子1(ica1)和血管细胞粘附分子1(vca1)，所有这些都有助于由辐射引发的持久和全身抗肿瘤免疫。另一方面，放疗促进了肿瘤细胞的免疫逃避。例如，r上调多种免疫抑制细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子-α(nf-α)、il-6、il-10和转化生长因子-β(gf-β)。r促进免疫抑制细胞的积累，例如肿瘤相关巨噬细胞(a)、调节性(reg)细胞和髓源性抑制细胞(dsc)。辐射增强免疫检查点的活性，如程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)/pd-l1、细胞毒性淋巴细胞相关蛋白4()、细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域的蛋白3(i3)，和淋巴细胞激活基因3(g3)。

为了克服放疗的免疫抑制作用，已经提出并测试了免疫疗法和放疗的各种组合。在pacific研究中，标准放化疗后加入durvaab可延长iii期nsclc患者的无进展生存期和总生存期。pacific研究的巨大成功不仅改变了iii期非小细胞肺癌的临床指南，也引起了其他免疫疗法与r结合的极大兴趣。

dscs的积累和激活在免疫抑制的建立中起关键作用。r对dscs的确切影响是复杂的。大分割照射(20gy)抑制dscs的积累和浸润，而较低剂量的照射往往会促进dscs募集到肿瘤中。此外，临床前和临床研究表明，胃肠道肿瘤，包括结直肠癌和肝癌，在放疗后相对容易出现dscs水平降低，而在其他肿瘤模型和临床环境中，如胶质瘤、肺癌、乳腺癌、头颈部鳞癌、前列腺癌和宫颈癌，导致dsc数量持续增加。蔡等人首次报道dscs的pd-l1表达被辐照上调。然而，关于dscs的确切作用，尤其是其潜在机制，在辐照后塑造方面知之甚少。

dscs是一组具有强大免疫抑制能力的异质髓细胞。根据表型和形态，dscs又可分为多形核ds-dscs，又称粒细胞型dscs)和单核型dscs(-dscs)。

免疫抑制活性是dscs的关键标志。dscs的抑制机制包括诱导型一氧化氮合酶(os)、精氨酸酶1(arg1)和吲哚胺2，3-双加氧酶(ido)的表达，以及一氧化氮(no)和活性氧(ros)的产生。这些不同的机制不会同时起作用。人们普遍认为pn-dscs和-dscs通过不同的机制调控。此外，pd-l1的上调也被认为是辐射招募dscs的免疫抑制机制之一。目前，对于辐照诱导的dscs对的影响及放疗的治疗效果尚无一致的结论。

磷酸二酯酶-5(pde5)抑制剂，如西地那非和他达拉非，可以阻断环磷酸鸟苷(cgp)的水解。最新数据表明，pde5抑制剂能够通过抑制荷瘤(b)小鼠和患者dsc中1的活性和表达来促进抗肿瘤免疫。然而，pde5抑制剂如何影响dsc的亚群以及r和pde5抑制剂的组合是否会延迟辐射后的肿瘤再生尚未得到测试。

我们最近的研究表明，消除招募的dsc会延迟放疗后路易斯肺癌(llc)的再生。在这里，我们报告了局部照射通过促进pn-dsc的增殖及其随后向的募集而削弱了抗肿瘤免疫力。arg1的上调和激活是照射后pn-dscs介导的细胞抑制的主要机制。西地那非与放疗的组合通过抑制arg1过表达和pn-dsc募集消除了辐射衍生的免疫抑制。

在b小鼠和癌症患者中，dscs随着肿瘤的生长而扩增。dscs的两个亚群之间的比例取决于特定的肿瘤模型和微环境。为了监测同源llc模型中dsc的丰度，我们通过免疫表型分析确定了接种后肿瘤的生长以及llc小鼠中不同时间点的总体dsc及其亚群。

如图1c所示，肿瘤组织中总dscs的百分比随着肿瘤的发展而稳步增加，从接种后第一周肿瘤浸润淋巴细胞的不到10（584±122）上升到第四周超过20（2171±322）（p<001）。在我们的llc模型中，pn-dscs占总dscs的9494±847，并且与总dscs具有相同的肿瘤发展趋势（p<005）。对亚群进行分析，虽然-dscs增加了大约5倍，但差异没有统计学意义。

为了更好地了解dscs的全身分布，我们还研究了dscs在外周血、脾脏和骨髓中的比例。仅在接种llc细胞一周后，b小鼠外周血中的dsc百分比是无瘤小鼠的两倍(2733±462vs1248±093，p<005)，3周后的dsc百分比是无瘤小鼠的5倍(2733±462vs1248±093，p<005)。b小鼠外周血中pn-dscs的比例也增加，而-dscs的比例与肿瘤大小无关。

pd-l1是肿瘤细胞、dscs、巨噬细胞和树突状细胞表达的最重要的检查点分子之一。为了确定b小鼠dscs的pd-l1表达是否与健康小鼠不同，我们通过流式细胞术测试了dscs的pd-l1表达。结果表明，中dscs上pd-l1的平均荧光强度（fi）从在llc细胞接种后的第一周3868±1009逐渐增加到第四周的1，0680±1218（p<001），这表明pd-l1在我们模型中的dsc中具有潜在作用。

在脾脏和骨髓中，随着肿瘤的发展，dscs的比例也显著增加，其模式与肿瘤组织和外周血中的dscs相同。此外，我们在b小鼠中观察到明显的脾肿大，这与我们观察到的dscs在脾内聚集一致。

为了确定局部照射对肿瘤生长和dscs的影响，当肿瘤直径达到75时，我们使用大分割r(20gy/f)治疗皮下llc肿瘤。放疗导致肿瘤进展延迟长达一周，在第7至第10天的最小体积约为5003，但此后肿瘤开始再生。根据放疗前后肿瘤生长曲线，我们选择放疗后第3天为再生前生长，放疗后1周为肿瘤体积最小时为再生开始，放疗后2周和3周为再生阶段。肿瘤组织苏木精-伊红染色显示，与未治疗的肿瘤相比，放疗后的肿瘤中有更多的浸润性炎症细胞。随后的cd11b特异性免疫组化染色显示，大多数炎症细胞是cd11b+髓系细胞，这表明局部照射可能导致dscs的积累。为了证实我们的假设，我们在局部照射后的不同时间点对总dscs和这两个亚群进行了流式细胞术分析。局部照射后，放疗后肿瘤浸润dscs的比例比未治疗肿瘤高2倍(crlvsr=2133±329vs4410±300，p<0001)。pn-dscs与总dscs具有相同的增加趋势(crlvsr=1637±247vs3866±424，p<0001)，而-dsc比例保持在约01，且与肿瘤大小和治疗无关。外周血情况同肿瘤组织。

为了确定受照射肿瘤中pn-dsc的逐渐积累是否有助于llc肿瘤的再生长，或者这种积累是否仅仅是肿瘤生长的结果，使用抗ly-6g单克隆抗体来消耗dsc抗ly-6g抗体的应用显着降低了肿瘤部位和外周血中pn-dsc的频率（p<005）。此外，用抗ly-6g抗体治疗大大延迟了照射后的再生，这表明pn-dsc的募集对肿瘤再生至关重要。

虽然pn-dscs利用一系列机制来抑制抗肿瘤免疫反应，这涉及到许多免疫细胞和细胞因子，但对cd8+细胞的抑制无疑是最重要的。为了确定r后pn-dscs诱导的免疫抑制是否依赖于cd8+细胞，我们通过流式细胞术评估了cd8+细胞的数量和功能。

如图3d所示，cd8+细胞的百分比随着照射从1171±231下降到242±062(p<001)。pn-dsc耗竭逆转了这种下降（r+ani-ly-6g抗体=242±062vs2012±392，p<001）。为了更好地了解cd8+细胞浸润肿瘤部位的功能状态，我们测量了cd8+细胞内部和表面上ifn-γ、cd28和pd-1的表达。局部r显着降低了cd8+细胞分泌ifn-γ的比例，从3306453降至1325208，并增加了表达pd-1的cd8+细胞的比例（crlvsr=25320±5703auvs53880±9876）au，p<005）。

cd28表达未观察到显着变化。当抗ly-6g抗体被给予辐照小鼠时，ifn-γ分泌达到与未处理的llc小鼠相同的水平（2974±355），而与辐照小鼠进行比较抗ly-6g抗体处理后的pd-1表达没有变化小鼠。因此，在这部分我们建议pn-dscs通过抑制cd8+细胞促进放疗后肿瘤的再生。pn-dscs不仅抑制了中cd8+细胞的数量，而且还抑制了其活性。

为了确定辐照诱导dscs的抑制机制，我们进行了免疫组化染色及1活性检测。肿瘤切片的免疫组化染色显示，局部r增强了arg1的表达，但没有增强os的表达。arg1活性测定表明，局部照射显著提高了arg1的活性，从040015u/l提高到378039u/l((p<001)。相比之下，no荧光标记的os活性检测显示，辐照和未处理的肿瘤组织样本的荧光强度相似。

pd-l1的表达是dscs的一种新型免疫抑制机制。然后我们询问pd-l1上调是否是r后dscs介导的免疫抑制的机制之一。通过流式细胞术分析辐照后dsc中pd-l1的表达。图4e显示，与未处理组相比，受照射肿瘤的dsc中的pd-l1表达在照射后不久显着增加（照射后第三天crlvsr=4439±1753auvs13280±3243au，p<005）然而，此后pd-l1表达继续下降，局部照射组在照射后第3周显着低于未治疗组（crlvsr=1，4650±3996auvs4075±1648au，p<005）。外周血中dscs的pd-l1表达与局部肿瘤部位的表达趋势相同。

以上数据表明arg1表达的上调是照射后pn-dscs抑制功能的合理机制。然而，不涉及pd-l1和os的调节。为了进一步证实这一假设，在辐射后通过灌胃给予arg1抑制剂nor-noha。10g/kg/dnor-noha有效地将arg1活性从378039u/l降低到202025u/l（p<001）。

r后给予nor-noha显着增加cd8+细胞比例（rvsr+nor-noha=242062vs614064，p<001），并伴有肿瘤再生延迟。os抑制剂1400对肿瘤再生长没有影响。

我们的结果表明，r通过上调肿瘤内pn-dsc的百分比和arg1活性来促进肿瘤免疫逃避。推测抑制pn-dscs及其arg1活性可能是一种新的抗肿瘤策略是合理的。越来越多的证据表明，pde5抑制剂可以抑制b小鼠和癌症患者dsc中1的活性和表达。因此，通过灌胃给予西地那非20g/kg/d，以研究它是否可以促进r的抗肿瘤作用并阐明潜在机制。如图5b所示，正如我们预期的那样，西地那非延迟了照射后的肿瘤再生长，这与阳性对照nor-noha相当。的免疫特征表明，当给予西地那非时，肿瘤内pn-dsc的比例从3866±424下降到57±238。

此外，西地那非也显着降低了arg1的表达。为了进一步检查西地那非对dsc的抑制是否真的导致抗肿瘤免疫增强，我们分析了肿瘤内cd8+细胞的比例和活性。流式细胞术分析表明cd8+细胞的百分比从242±062增加到721±122。

此外，当给予西地那非时，cd8+细胞分泌的ifn-γ也显着升高。因此，我们证实pde5抑制剂西地那非通过调节pn-dscs改善了照射后肿瘤免疫微环境。西地那非联合放疗可能是提高放疗疗效的一种有前景的策略。

工作揭示了pn-dscs中arg1通路介导r后肿瘤再生的新机制，如图6所示。我们认为，pn-dscs是辐照招募的主要亚型，而不是-dscs。在广泛的免疫抑制机制中，arg1的上调和激活是pn-dscs在放疗后抑制cd8+细胞的主要机制。为了克服pn-dscs引起的免疫抑制，我们提出并证明，sildenafil和r联合使用降低了pn-dscs在内的募集和免疫抑制作用，激活了cd8+细胞应答，导致肿瘤生长延迟。综上所述，我们的研究结果为缓解免疫抑制以提高r治疗效果提供了一种新的解决方案。虽然所有这些结果都是在llc小鼠模型中进行的，但同样的机制是否适用于其他肿瘤模型尚不清楚。此外，在不同的辐射方案下，dscs及其亚型如何影响仍未确定。因此，这些问题还需要进一步的研究来解决。